Nukleorūgščių sintezės principai

Nukleino rūgščių sintezė atliekama naudojant kietosios fazės sialo amido trigliceridų metodą, kai DNR 3′ galas imobilizuojamas ant kietosios fazės substrato ir nukleotidai pridedami 3′–5′ kryptimi, kol susintetinamas norimas DNR fragmentas. .Tai skiriasi nuo DNR sintezės naudojant DNR polimerazę.

Pirmosios bazės 3′ galas imobilizuojamas ant CPG sintezės metu, kitos bazės 5′-OH yra apsaugotas di-p-toliltritil DMT, amino grupė ant bazės apsaugota benzenkarboksirūgštimi, o 3′ Tada -OH aktyvuojamas aminofosfato junginiu.1 bazė iš 1 bazės 5 5′-OH ir kitos bazės 3′-OH sudaro fosfito trigliceridą, kuris vėliau oksiduojamas jodu į fosfato trigliceridą, antroje bazėje esanti 5′-OH apsauga pašalinama pridedant dichloracto rūgšties DM ciklai pridedant kitą bazę, o po sintezės 5′-OH apsauginė medžiaga pašalinama silpna rūgštimi. Fragmentas atjungiamas nuo kietos dervos koncentruotu amonio hidroksidu, apsauga nuo bazės pašalinama. kaitinant koncentruotu amonio hidroksidu, amonio hidroksidas pašalinamas, fragmentas džiovinamas vakuume, o nukleorūgštis išgryninama skysčių chromatografija arba PAGE.

Oligo sintezės žingsniai

Atblokavimas

The5 galų DMT apsauginė grupė pašalinama pridedant TCA tirpalo.

Aktyvinimas

Aktyvatoriaus sumaišymas su oligonukleotido monomeru, kad susidarytų aktyvus oligonukleotido monomero tarpinis produktas.

Sukabinimas

5-galinė hidroksilo grupė reaguoja su aktyviu oligonukleotido tarpiniu produktu antigeneracinėje kondensacijos reakcijoje, sudarydama nestabilią fosfito trigliceridinę jungtį.

Apribojimas 

Pridėjus uždarymo agento, vyksta acetilinimo dangtelio reakcija su hidroksilo grupių pertekliumi, kurios nedalyvauja kondensacijos reakcijoje.

Oksidacija 

Jodo tirpalo, kuriame yra vandens, pridėjimas oksiduodamasis reaguoja su nestabiliomis fosfito jungtimis ir susidaro stabilūs fosforo rūgšties trigliceridiniai ryšiai.

Cianoetilo skilimas

Nukleino rūgšties produktas po sintezės, pridedant DEA tirpalo, kad būtų pašalinta cianoetilo grupė iš fosfato trigliceridinės jungties.

Suskaidytas ir apsaugos pašalinimas

Nukleino rūgščių fragmentai atskiriami nuo kietosios fazės nešiklio, pridedant koncentruoto amonio hidroksido tirpalo, o po to kaitinami, kad būtų pašalintos apsauginės grupės nuo bazių vandenilinių jungčių.